近日，bevictor伟德官网汪誠文教授團隊和澳大利亞昆士蘭大學郭建華副教授團隊、鄭敏博士在ISME Communications（國際微生物生态學會通訊）創刊首期在線發表題為“Selective enrichment and metagenomic analysis of three novel comammoxNitrospirain a urine-fed membrane bioreactor（尿液為進水的膜生物反應器中三種新型全程硝化菌的選擇富集及代謝特征）”的研究論文。研究人員利用實際尿液廢水成功富集到三種全新的全程硝化細菌（Complete Ammonia Oxidizer，Comammox Nitrospira），宏基因組學分析表明，這些新型全程硝化菌具有尿素利用的全部路徑。該論文研究并指出，除低氨氮和長SRT兩個條件外，尿液廢水中的尿素可能促進了全程硝化菌的選擇富集。該發現進一步更新了對參與氮循環微生物的認識。
生物硝化過程是全球氮循環中的重要一環，該過程一直以來被認為是由氨氧化菌（Ammonia-oxidizing Bacteria, AOB）和亞硝酸鹽氧化菌（Nitrite-oxidizing Bacteria, NOB）分兩步來完成的。2015年，全程硝化菌（Comammox Nitrospira）的發現打破了對硝化過程的傳統認知。全程硝化菌一種微生物能承擔AOB和NOB的共同功能而獨自将氨氮氧化為硝酸鹽。目前，各國研究人員已經在多個生态系統和工程系統中檢測到了全程硝化菌，如濕地、河床沉積物、飲用水系統、污水處理系統等。然而，目前我們對全程硝化菌的認知仍處于初級階段，尤其是對于如何富集培養全程硝化菌的關鍵條件仍不十分清晰。
該聯合團隊将尿液廢水作為膜生物反應器（MembraneBio-Reactor, MBR）的進水，成功在200天内實現了全程硝化菌的富集（相對豐度高達30%）。該反應器表現出了良好的硝化效果，進水中總凱氏氮全部被氧化為硝酸鹽氮，出水中無亞硝酸鹽積累（圖1b），最高去除負荷達188 mg N·L−1d−1（圖1a）。16SrRNA擴增子測序結果表明，該微生物群落中硝化螺菌屬Nitrospira占主導地位，傳統AOB Nitrosomonas則在反應器運行至第161天後逐漸被淘汰，而Nitrospira的相對豐度最高上升至高于30%（圖1c）。qPCR對不同種類amoA基因的變化分析結果進一步證明了富集的Nitrospira大部分是攜帶amoA基因的Comammox Nitrospira，而并非傳統的NOB，它們的amoA基因拷貝數增加了4個數量級，而AOB和AOA的amoA基因拷貝數始終處在較低水平（圖1d）。這些結果共同證明了全程硝化菌Nitrospira在以尿液廢水為進水的MBR反應器中得到了選擇性富集，并逐步淘汰了AOA和AOB。
圖1 以尿液廢水為進水的MBR反應器硝化效果及硝化菌群組成。（a）TKN去除負荷；（b）氨氮及亞硝酸鹽轉化；（c）基于16S rRNA基因擴增測序的Nitrospira和Nitrosomonas相對豐度變化；（d）基于qPCR的全程硝化菌Nitrospira、AOB和AOA amoA基因的變化
借用宏基因測序技術和生物信息分析，研究人員成功獲得了三個全程硝化菌Nitrospira全基因組序列。通過對于這些基因組的注釋分析，這三個全程硝化菌Nitrospira均同時攜帶了氨氧化和亞硝酸鹽氧化的全部基因序列。根據系統發育分析的研究結果，本研究富集的全程硝化菌Nitrospira在進化發育上均屬于Nitrospira譜系Ⅱ中的CladeA，并且與已知的全程硝化菌對比平均氨基酸指數小于90%（圖2），确定為三種全新的全程硝化菌。
圖2 富集的全程硝化菌Nitrospira的系統發育樹分析以及同其他全程硝化菌Nitrospira的平均氨基酸指數比較
研究人員利用宏基因組技術進一步分析了全程硝化菌Nitrospira代謝尿素的潛能，以揭示尿素誘導全程硝化菌富集的機理。分析結果證明，這些全程硝化菌包含了利用尿素的完整路徑，尿素轉運基因urtABCDE、脲酶亞基ureABC、脲酶輔助基因ureDFGH（圖3b）。在該微生物種群中，源于全程硝化菌Nitrospira的ureC基因在所有的ureC基因中占比達到了41%–66%，表明它們可能是MBR中代謝尿素的主要貢獻者（圖3a）。系統發育分析表明，Nitrospira門中編碼ureABC蛋白質的基因形成了一個深遠的分支簇，說明了水解尿素是Nitrospira屬一個古老的特性（圖3c）。此外，本研究中富集的三株全程硝化菌Nitrospira的ureABC與其他分泌脲酶的CladeA成員在Nitrospira屬中形成了一個單系簇（圖3d）。
圖3 MBR中微生物群落檢測到的ure操縱子。（a）群落中含脲酶微生物的相對豐度。從三個宏基因組中提取所有的ureC基因，并通過計算特定ureC基因與所有檢測到的ureC基因的比對片段數目估算它們的相對豐度。（b）Nitrospira屬中脲酶和尿素轉運操縱子示意圖。箭頭代表基因，表示轉錄方向。（c）從所有公開可用的原核基因組中提取的編碼ureABC蛋白序列的系統發育樹。（d）從所有公開可用的Nitrospira屬中提取的編碼ureABC蛋白序列的系統發育樹。這兩個系統發育樹都是用1000次bootstrap複制計算的，黑色圓圈表示bootstrap支持度為70%。
本研究還構建了新發現的全程硝化菌Nitrospira的代謝示意圖（圖4）。宏基因組學分析結果表明，富集的全程硝化菌Nitrospira可以利用尿素作為替代氮源，在将尿素水解氨化為氨氮後，利用氨氮進一步進行硝化反應，最終轉化為硝酸鹽。目前通常認為，富集全程硝化菌的條件包含低氨氮濃度和長SRT，本研究中反應器實現了總凱氏氮到硝酸鹽的氧化，出水中基本不包含氨氮，保證了反應器中低氨氮的生長條件。同時，膜反應器在長時間運行中無刻意排泥，保證了長SRT條件，從而有助于全程硝化菌Nitrospira的富集。值得注意的是，反應器運行過程中保持溶解氧濃度在4mg/L以上，說明低溶解氧條件不是富集全程硝化菌必要的。此外，本研究采用尿液廢水作為進水，而全程硝化菌包含尿素利用的完整基因，因此，尿素的供給可能是全程硝化菌Nitrospira能夠選擇性富集的主要決定因素。
圖4 MBR反應器中富集的全程硝化菌Nitrospira細胞代謝示意圖
本研究發表在Nature Publication Group（自然出版集團）旗下ISME Communications期刊上，論文第一作者為bevictor伟德官网博士研究生李繼雲和中國科學技術大學環境科學與工程系花正雙研究員。通訊作者為bevictor伟德官网汪誠文教授，澳大利亞昆士蘭大學高等水管理研究中心郭建華副教授和鄭敏博士。參與該研究的作者還包括bevictor伟德官网白鴿和昆士蘭大學劉濤博士和博士研究生李潔，以及來自荷蘭内梅亨大學的Mike Jetten（邁克·耶滕）教授和Sebastian Lücker博士。
論文鍊接：https://www.nature.com/articles/s43705-021-00005-3
